Wirusowe zapalenie wątroby. Diagnostyka serologiczna.
Wirusowe zapalenie wątroby jest następstwem zakażenia jednym z poznanych wirusów hepatotropowych: HAV (Hepatitis A Virus), HBV (Hepatitis B Virus), HCV (Hepatitis C Virus), HDV (Hepatitis D Virus), HEV (Hepatitis E Virus), HGV(Hepatitis G Virus). W naszej strefie geograficznej najczęściej dochodzi do zachorowań na wirusowe zapalenie wątroby typu A (WZWA), typu B (WZWB) i typu C (WZWC) wywoływane przez HAV, HBV i HCV odpowiednio.

Dokładny patomechanizm choroby wątroby nie jest w pełni wyjaśniony. W świetle dotychczasowych ustaleń przyjmuje się, że kluczową rolę w uszkodzeniu hepatocytów z następową ich lizą odgrywa interakcja pomiędzy układem odpornościowym gospodarza (odpowiedź komórkowa i humoralna), a antygenami wirusa i antygenowo zmienioną w następstwie zakażenia błoną komórkową hepatocytów.

Diagnostyka wirusowego zapalenia wątroby jest prowadzona w oparciu o badania lekarskie (podmiotowe i przedmiotowe) oraz wyniki laboratoryjnych testów funkcji wątroby (aminotransferazy alaninowa i asparaginianowa, fosfataza alkaliczna,
g-Glutamylotransferaza, czas protrombinowy, bilirubina i inne). Natomiast rozpoznanie typu WZW, określenie fazy zakażenia
i prognozowanie jego przebiegu jest niemożliwe bez wyników specyficznych testów serologicznych. Badania serologiczne obejmują oznaczanie składowych wirusa (antygeny) i produktów swoistej odpowiedzi humoralnej gospodarza (przeciwciała). W ostatnich latach coraz większą rolę odgrywa diagnostyka molekularna - jakościowe i ilościowe oznaczanie wirusowych kwasów nukleinowych (Nucleic Acid Testing - NAT) .

Należy pamiętać, że we współczesnej medycynie laboratoryjnej każde badanie jest swoistą formą konsultacji medycznej, mającej na celu pomóc lekarzowi w rozpoznaniu, potwierdzeniu lub wykluczeniu choroby oraz monitorowaniu jej przebiegu
i skuteczności wdrożonego leczenia. Dlatego też wyniki badań serologicznych winny być zawsze rozpatrywane w kontekście innych badań laboratoryjnych i lekarskich.

Wirusowe Zapalenie Wątroby typu A.
Czynnikiem etiologicznym WZWA jest RNA wirus o średnicy 27-28 nm. Badania epidemiologiczne wykazują, że zakażenia HAV występują na całym świecie i są szczególnie częste na obszarach o niskim standardzie sanitarno-higienicznym. Wirus jest wydalany z ustroju zakażonego osobnika wraz z kałem, a zanieczyszczone fekaliami środowisko staje się rezerwuarem wirusa. Spożywanie artykułów z takiego środowiska, głównie niemytych jarzyn i warzyw prowadzi do kolejnych zakażeń. Zakażenie HAV przebiega łagodnie z następową całkowitą eliminacją wirusa. Okres inkubacji zakażenia HAV, mierzony
od chwili wniknięcia drobnoustroju do organizmu do wystąpienia pierwszych objawów choroby, waha się od 14 do 45 dni (średnio około 28 dni). Pierwszym serologicznym wykładnikiem zakażenia jest antygen wirusowy – HAVAg stwierdzany w kale (Rys.1).

Antygen jest wykrywalny przez okres 2 - 4 tygodni, a największe jego stężenie obserwuje się bezpośrednio przed pojawieniem się klinicznych i laboratoryjnych wykładników choroby wątroby. Z chwilą wystąpienia objawów chorobowych pojawiają się w surowicy specyficzne przeciwciała anty-HAV skierowane przeciwko antygenom wirusa. W pierwszej fazie są to przeciwciała klasy IgM. Ich miano narasta w ciągu kilku dni a w miarę upływu czasu stopniowo spada, aż do zupełnego zaniku po upływie 6 – 9 miesięcy. Równolegle, choć w mniejszym tempie, pojawiają się przeciwciał anty-HAV klasy IgG. W odróżnieniu od przeciwciał klasy IgM utrzymują się one latami, stanowiąc naturalną ochronę przy kolejnym kontakcie z HAV. Z wymienionych trzech serologicznych wykładników zakażenia HAV (anty-HAV IgM, anty-HAV IgG, HAVAg) praktyczne znaczenie w rutynowej diagnostyce WZWA mają przeciwciała anty-HAV klasy IgM pod warunkiem, że badanie jest wykonywane w ostrej fazie choroby. Pozostałe markery są wykorzystywane do badań epidemiologicznych, czy też naukowych. Pozytywny wynik badania przeciwciał anty-HAV IgM potwierdza ostrą fazę wirusowego zapalenia wątroby typu A. Wynik negatywny wyklucza zakażenie HAV i w przypadku podejrzenia WZW nakazuje wykonanie testów serologicznych, specyficznych dla innych wirusów hepatotropowych.


Wirusowe zapalenie wątroby typ B
Czynnikiem etiologicznym WZW typu B (WZWB) jest kompletny DNA wirus o średnicy około 42 nm zwany również,
od nazwiska jego odkrywcy, cząstką Dane'a (Rys. 2). W budowie morfologicznej wirusa wyodrębniono komponent powierzchniowy - HBsAg (Hepatitis B surface Antigen) i komponent rdzeniowy - HBcAg (Hepatitis B core Antigen). Wewnątrz komponentu rdzeniowego znajduje się kulisty, częściowo dwuniciowy DNA, polimeraza DNA (PDNA) i antygen "e" - HBeAg (Hepatitis B e Antigen). W przeciwieństwie do antygenów HBs i HBc, które mają określone struktury morfologiczne antygen HBe jest rozpuszczalnym polipeptydem. W surowicy osób zakażonych obok wirusów kompletnych występują struktury sferyczne o średnicy 22 nm i tubularne o takiej samej średnicy i różnej długości dochodzącej do 240 nm. Obie struktury, sferyczna i tubularna, wykazują identyczną reaktywność serologiczną jak komponent powierzchniowy wirusa - antygen HBs. Zarówno cząstki sferyczne jak i tubularne są immunogenne, tzn. stymulują układ odpornościowy gospodarza do wytwarzania swoistych przeciwciał, ale w odróżnieniu od wirusa kompletnego nie zawierają materiału genetycznego i nie są w stanie wywołać zakażenia.

Zakażenie HBV jest przenoszone droga parenteralną (krew i inne płyny ustrojowe) w następstwie używania niesterylnego sprzętu medycznego lub kosmetycznego, z zakażonych matek na noworodki najczęściej w okresie okołoporodowym, podczas kontaktów hetero i homoseksualnych z zakażonym partnerem, po podaniu zakażonej krwi lub preparatów krwiopochodnych. Szczególną ostrożność ze względu na ryzyko bezpośredniego kontaktu z materiałem biologicznym winni zachować pracownicy placówek medycznych, w tym i laboratoriów diagnostycznych. Obecność wirusa stwierdza się nie tylko we krwi, ale i w innych płynach ustrojowych.

Okres wylęgania WZWB wynosi od 30 do 180 dni i jest częściowo uzależniony od dawki inokulacyjnej i ogólnego stanu zdrowia gospodarza. Wymienione składowe wirusa i homologiczne w stosunku do antygenów produkty odpowiedzi humoralnej mogą być stwierdzane w surowicy osób zakażonych, a ich wykrywalność będzie zależała od fazy i przebiegu zakażenia.

HBsAg
Pierwszym wykrywalnym wykładnikiem zakażenia HBV jest HBsAg, który pojawia się w surowicy jeszcze przed wystąpieniem klinicznych i laboratoryjnych objawów choroby wątroby (Rys. 3). W samo-gojącym się ostrym WZWB antygene¬mia HBs utrzymuje się przez okres 2-6 tygodni, a w około 5% przypadków zakażeń HBsAg znika z surowicy jeszcze przed wystąpieniem klinicznych i laboratoryjnych objawów choroby.

HBeAg
W kilka do kilkunastu dni po antygenie HBs pojawia się w surowicy antygen HBe. Obecność HBeAg jest pośrednim dowodem trwającej replikacji wirusa w hepatocytach (wysoka korelacja z ładunkiem wirusa we krwi mierzonego stężeniem wirusowego DNA) i wskazuje na wysoką zakaźność badanego. Okres występowania antygenu HBe jest krótszy aniżeli HBsAg. Przyjmuje się, że utrzymywanie się antygenemii HBe dłużej niż 10-12 tygodni jest objawem prognostyczne niekorzystnym i może wskazywać na przejście zakażenia z fazy ostrej w fazę przewlekłą.

HBcAg
Oznaczanie HBcAg ze względu na skomplikowaną procedurę metodyczną (konieczność usunięcia otoczki powierzchniowej)
i ograniczoną przydatność diagnostyczną tego badania nie jest wykonywane w rutynowej diagnostyce zakażeń HBV.

anty-HBc
W kilka do kilkunastu dni po HBeAg pojawia się we krwi pierwszy produkt odpowiedzi humoralnej gospodarza - przeciwciała anty-HBc. Przeciwciała te pojawiają się równolegle lub krótko przed wystąpieniem klinicznych objawów choroby wątroby.
W pierwszej fazie są to przeciwciała klasy IgM. Miano ich narasta bardzo szybko, a w miarę upływu czasu stopniowo spada, aż do całkowitego zaniku po okresie 6-9 miesięcy. Niski poziom przeciwciał anty-HBc IgM może być również stwierdzany
w niektórych przypadkach przewlekłych zapaleń wątroby z aktywnym procesem chorobowym (przewlekłe agresywne zapalenie wątroby, marskość pozapalna). W pewnej fazie zakażenia, kiedy antygeny HBs i HBe, oraz homologiczne przeciwciała anty-HBe i anty-HBs są niewykrywalne, przeciwciała anty-HBc IgM mogą być jedynym dowodem ostrej fazy trwającego zakażenia HBV. Dotyczy to przypadków, w których antygenemia HBe i HBs ustępuje przed wystąpieniem klinicznych objawów choroby, oraz części przypadków nadostrego zapalenia wątroby (hepatitis fulmi¬nans). Równolegle
z przeciwciałami anty-HBc IgM pojawiają się przeciwciała anty-HBc klasy IgG. W odróżnieniu od anty-HBc IgM przeciwciała klasy IgG utrzymują się latami, często do końca życia bez względu na fazę zakażenia i profil pozostałych serologicznych markerów zakażenia HBV.

anty-HBe
W kilka dni do kilku tygodni po ustąpieniu antygenemii HBe pojawiają się homologiczne przeciwciał anty-HBe. Pojawienie się przeciwciał anty-HBe wskazuje na zahamowanie replikacji wirusa i obniżającą się, ale nie wykluczoną zaraźliwość. U części chorych z takim profilem serologicznych wykładników zakażenia HBV stwierdza się jeszcze obecność wirusowego DNA
i PDNA.

anty-HBs
Jako ostatnie pojawiają się przeciwciała anty-HBs. Okres od ustąpienia antygenemii HBs do pojawienia się przeciwciał anty-HBs waha się od kilkunastu dni do kilku miesięcy. Pojawienie się przeciwciał anty-HBs świadczy o pełnej serokonwersji
i wyeliminowaniu wirusa z ustroju.
Przedstawioną sekwencję zdarzeń serologicznych z następową eradykacją wirusa obserwuje się u osób dorosłych w około 85% - 90% przypadków zakażeń . W pozostałych 10 - 15% przypadków zakażenie z fazy ostrej przechodzi w fazę przewlekłą. U noworodków rodzących się z matek nosicielek wirusa, jeżeli nie będzie wdrożone właściwe postępowanie lekarskie w okresie okołoporodowym, proporcje te mogą być odwrotne - w około 90% przypadków zakażenie z fazy ostrej, często bezobjawowej, przechodzi w przewlekłą z wszystkimi tego konsekwencjami.

Przewlekłe zakażenie HBV
O przewlekłym zakażeniu HBV mówimy wtedy jeżeli nie doszło do eliminacji wirusa z ustroju (antygen HBs jest ciągle wykrywalny) po okresie dłuższym niż 6 miesięcy (Rys. 4a).

W badaniach serologicznych stwierdza się w surowicy obecność antygenów HBs i HBe. W miarę upływu czasu u części zakażonych (10% - 30 % w skali roku) dochodzi do eliminacji HBeAg i pojawienia się przeciwciał anty-HBe (Rys. 4b),
a u około 2% do pełnej serokonwersji i pojawienia się przeciwciał anty-HBs.

Utrzymujący się przez dłuższy okres czasu profil markerów HBsAg /+/, anty-HBe/+/, może świadczyć o tym, że doszło
do integracji wirusowego DNA z genomem gospodarza. W surowicy tych osób nie stwierdza się HBV DNA i PDNA,
a występujący HBsAg jest małą strukturą sferyczną. Tę fazę zakażenia określa się jako niereplikacyjną lub integracyjną.
W następstwie przewlekłego zakażenia HBV mogą rozwinąć się różne formy przewlekłych chorób wątroby, począwszy
od przewlekłego przetrwałego zapalenia wątroby (hepatitis chronica persistens) poprzez przewlekłe agresywne zapalenie wątroby (hepatitis chronica agressive) i marskość pozapalną (cirrhosis hepatis postnecrotica) do pierwotnego raka wątroby włącznie (carcinoma hepatocellulare). Dlatego też zaleca się okresowe badania kontrolne laboratoryjnych testów funkcji wątroby poszerzonych o AFP.

W diagnostyce serologicznej zakażeń HBV mamy do dyspozycji pięć różnych markerów. Spośród nich najczęściej wykonywane jest oznaczanie antygenu HBs. Powody zlecenia tego badania są zróżnicowane - począwszy od badania przy podejrzeniu zakażenia HBV, poprzez obligatoryjne badanie dawców tkanek i narządów oraz ciężarnych kobiet, okresowe badania kontrole przewlekle dializowanych, aż do przypadków badania pacjentów przed zabiegiem chirurgicznym lub endoskopią. Diagnosta laboratoryjny musi mieć świadomość, że wynik tego badania bez względu na jego cel warunkuje dalsze postępowanie lekarskie (np. dodatni wynik wyklucza dawcę, determinuje wdrożenie odpowiedniej procedury prowadzenia ciężarnej i noworodka, itp.). Ze względu na wspomniane znaczenie wyniku HBsAg każde jego badanie winno być przeprowadzane z należytą starannością i przy zachowaniu zasad dobrej praktyki laboratoryjnej.

Wirusowe zapalenie wątroby typu C.
Czynnikiem etiologicznym wirusowego zapalenia wątroby typu C (WZWC) jest RNA wirus o średnicy około 50nm, należący do rodziny Flaviviridae. W budowie genomu wirusa wyodrębniono 3 geny strukturalne (C, E1, E2) kodujące białka nukleokapsydu i otoczki powierzchniowej, oraz 5 genów niestrukturalnych (NS1, NS2, NS3, NS4, NS5) kodujących białka funkcjonalne (Rys.5.).

Analiza wirusowego RNA pozyskanego od zakażonych osób wykazała istnienie różnic w składzie i sekwencji nukleotydów.
W oparciu o stwierdzane różnice wyróżnia się 6 głównych genotypów i ponad 50 podtypów.


Zakażenie HCV, podobnie jak HBV czy HIV, jest przenoszone drogą parenteralną. Okres inkubacji liczony od chwili ekspozycji do pojawienia się pierwszych wykładników zakażenia waha się od 2 do 26 tygodni, średnio 8 tygodni. (Rys. 6).

W znacznej części przypadków zakażenie przebiega skrycie, bezobjawowo lub skąpo objawowo.
Bez względu na początkowy przebieg zakażenia, w większości przypadków (50% - 80%) przechodzi ono z fazy ostrej w fazę przewlekłą (Rys. 7).

Zakażenie przewlekłe HCV, podobnie jak i HBV może skutkować różnymi formami przewlekłych chorób wątroby począwszy od przewlekłego przetrwałego zapalenia wątroby poprzez przewlekłe agresywne zapalenie i marskość pozapalną wątroby, aż do pierwotnego raka wątroby włącznie.

Rutynowa diagnostyka serologiczna zakażeń HCV rozpoczyna się od badania przeciwciał anty-HCV w surowicy.
W powszechnie stosowanych testach diagnostycznych wykorzystuje się rekombinowane lub syntetyczne analogi białek kodowanych zarówno przez strukturalne jak i niestrukturalne geny wirusa. Przy ocenie ujemnych wyników badań należy uwzględnić fakt, że nawet w testach III generacji przeciwciała anty-HCV są wykrywalne dopiero po upływie kilku do kilkunastu tygodni od chwili zakażenia. Czas ten może być jeszcze dłuższy u osób z obniżoną odpornością (np. AIDS, choroby nowotworowe, terapia immunosupresyjna). Z drugiej strony należy pamiętać, iż istnieje możliwość uzyskania wyniku fałszywie dodatniego. Duże problemy diagnostyczne nastręczają pacjenci poddawani hemodializom. Dane epidemiologiczne wskazują, że w tej grupie pacjentów do 10 % wyników dodatnich są to wyniki fałszywie dodatnie (MMWR, 2003, RR-3). Rekomendacje grup ekspertów zalecają aby wyniki dodatnie, a szczególnie o niskich wartościach odczytu były weryfikowane przy pomocy testu uzupełniającego - RIBA (Recombinant ImmunoBlot Assay). Niestety i w tym badaniu pewien odsetek wyników jest kwalifikowany jako badania "nierozstrzygnięte" - nie spełniające kryteriów zarówno wyniku ujemnego jak i dodatniego. Ze względu na „niedoskonałość” oznaczania przeciwciał anty-HCV w badaniu uzupełniającym, coraz częściej weryfikacji wyników badania anty-HCV dokonuje się w drodze oznaczeń materiału genetycznego wirusa (NAT - Nucleic Acid Testing)..
Należy podkreślić, że obecność przeciwciał anty-HCV nie daje podstaw do okreslenia fazy zakażenia, albowiem przeciwciała są wykrywalne zarówno w fazie wiremii jak i po eradykacji wirusa z ustroju (porównaj rys. 6 i 7). Ocena fazy zakażenia jest możliwe jedynie w oparciu o badanie materiału genetycznego wirusa. Badanie materiału genetycznego jest również konieczne przy kwalifikowaniu pacjentów do terapii przeciwwirusowej oraz monitorowaniu jej skuteczności.

Badania z zakresu diagnostyki WZW wykonują laboratoria SYNEVO.

dr n. przyrod. Mikołaj Własiuk