Diagnostyka genetyczna izolatów Escherichia coli

Firma Synevo proponuje wykonywanie dogłębnej analizy genetycznej izolowanych szczepów Escherichia coli. Pozwala ona na określenie chorobotwórczości tych bakterii. Obecnie sama identyfikacja bakterii do gatunku i oznaczenie lekooporności może być niewystarczające, szczególnie w zakażeniach przewlekłych, a także w ciężkich zakażeniach zagrażających życiu. Badania te należy wykonać w przypadku zakażeń układu moczowego, prostaty, układu pokarmowego, zakażeń przyrannych, sepsy, zakażeń kobiet w ciąży i noworodków.

Bakterie E. coli, tlenowe pałeczki Gram-ujemne z rodziny Enterobacteriaceae, należące do fizjologicznej flory przewodu pokarmowego, pojawiają się w organizmie człowieka od chwili narodzin i są obecne aż do śmierci. Na tle przeważającej dominacji komensali w ustroju człowieka wyróżniają się grupy klonalne E. coli, które w pewnych warunkach mogą spowodować infekcje. Niektóre szczepy E. coli w procesie ewolucji nabywają geny kodujące różnorodne czynniki wirulencji, dzięki którym zyskują potencjał chorobotwórczy. Geny te mogą być zlokalizowane na ruchomych elementach genetycznych (w obrębie chromosomalnych wysp patogenności, na plazmidach, transpozonach lub bakteriofagach), co zapewnia możliwość ich transferu na niechorobotwórcze szczepy E. coli lub pałeczki należące do innych gatunków. Dla takich szczepów E. coli konieczna jest dogłębna diagnostyka wykrywania charakterystycznych patotypów.

Wykrycie nosicielstwa i kolonizacji jelita grubego charakterystycznymi patotypami E. coli umożliwi wczesną eradykację tych bakterii z przewodu pokarmowego i zminimalizowanie ryzyka wystąpienia bakteriemii i/lub posocznicy i innych zakażeń o etiologii Escherichia coli.

Dogłębna diagnostyka izolowanych szczepów E. coli może obejmować:

– typowanie genetyczne izolatów E. coli w celu ustalenia pokrewieństwa genetycznego (wyodrębnienie genotypów) szczepów izolowanych z łożyska krwionośnego oraz innych organów i z przewodu pokarmowego u badanych pacjentów,

– identyfikację markerów genetycznych odpowiedzialnych za przynależność do określonych patotypów E. coli techniką PCR,

– wykrywanie techniką PCR obecności genu agn43 kodującego białko, które jest odpowiedzialne za agregację komórek E. coli w pierwszym etapie tworzenia biofilmu.

Taka diagnostyka ma na celu określenie predyspozycji tych szczepów do kolonizacji, infekcji i być może bakteriemii (bądź posocznic).

Typowanie genetyczne szczepów E. coli

Stworzono wiele metod typowania drobnoustrojów. Wygenerowanie określonych wzorów dla poszczególnych szczepów drobnoustrojów ułatwia ustalenie pokrewieństwa między nimi, pozwala potwierdzić bądź odrzucić hipotezę o ich wspólnym źródle pochodzenia oraz umożliwia monitorowanie drogi ich rozprzestrzeniania się w środowisku naturalnym bądź szpitalnym.

Analiza genetyczna będzie prowadzona z zastosowaniem metody typowania genetycznego PCR MP (ang. PCR Melting Profile), opartej na ligacji adaptora do wykreowania miejsc wiążących starter w reakcji PCR i na różnicach w temperaturach topnienia DNA amplifikowanych fragmentów restrykcyjnych. Różnicowanie szczepów E. coli techniką PCR MP będzie przeprowadzone za pomocą diagnostycznego zestawu opracowanego przez Krawczyk i wsp. [1,2]. Wyniki uzyskane przy jej użyciu pozwolą na określenie pokrewieństwa między badanymi szczepami E. coli pochodzącymi z krwi (oraz innych organów) i kału badanego pacjenta oraz ewentualnej ich transmisji w organizmie.

 

Badanie przynależności izolatów E. coli do określonych grup filogenetycznych

Clermont i wsp. w 2000 roku wykazali, że można wśród szczepów E. coli wyróżnić 4 grupy filogenetyczne (A, B1, B2, i D) o różnym stopniu wirulencji [3]. Podział ten stanowi obecnie podstawę klasyfikacji filogenetycznej pałeczek E. coli.

 

Na podstawie wieloletnich badań prowadzonych w różnych ośrodkach na świecie zaobserwowano pewne prawidłowości dotyczące zależności między przynależnością do określonej grupy a zdolnością do wywołania choroby. Bakterie komensalne, będące składnikiem naturalnej mikroflory, najczęściej należą do grupy B1 lub A. Bakterie wywołujące infekcje pozajelitowe, głównie w obrębie układu moczowego, najczęściej zaliczane są do grupy B2 lub D. Największą różnorodność obserwuje się wśród bakterii wywołujących biegunki – mogą one należeć do 4 grup filogenetycznych. Przyporządkowanie szczepów E. coli do określonych grup filogenetycznych z użyciem reakcji PCR opartej na amplifikacji genów chuA i yjaA oraz fragmentu DNA TspS4.C2 wg Clermont i wsp. [3].

Identyfikacja markerów genetycznych poszczególnych patotypów E. coli techniką PCR

Chorobotwórcze szczepy Escherichia coli zostały podzielone na 3 podstawowe grupy.

Pierwsza grupa obejmuje szczepy enteropatogenne odpowiedzialne za zakażenia przewodu pokarmowego, które dysponują zróżnicowanym arsenałem czynników wirulencji, co wiąże się z różnymi patomechanizmami wywoływanych przez nie zakażeń. Są to: enteropatogenne E. coli (EPEC – ang. Enteropathogenic E. coli), enterotoksykogenne E. coli  (ETEC – ang.  Enterotoxigenic E. coli), enteroinwazyjne E. coli (EIEC – ang. Enterioinvasive E. coli), enterokrwotoczne E. coli (EHEC – ang. Enterohemorhaic E. coli), enteroagregacyjne E. coli (EAEC – ang. Enteroaggregative E. coli) oraz odrywające komórki (CDEC – ang. Cell-deatching E. coli).

Druga grupa to szczepy wywołujące zakażenia układu moczowego (UPEC – ang. Uropathogenic E. coli).

Gupa trzecia to szczepy wywołujące posocznice oraz zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych u dzieci (MNEC – ang. Meningitis/Sepsis – associated E. coli).

Bakterie E. coli należące do pierwszej i drugiej grupy umieszczono w grupie szczepów powodujących infekcje pozajelitowe (ExPEC – ang. Extraintestinal Pathogenic E. coli).

Szczepy wirulentne E. coli, wywołujące pozajelitowe infekcje u człowieka (ExPEC), zawdzięczają swoją potencjalną patogenność obecności różnych czynników zjadliwości, które odpowiedzialne są za kolonizację powierzchni błony śluzówki gospodarza (włączając w to zdolność do tworzenia biofilmu), uszkodzenie i wniknięcie do tkanek (głównie α-hemolizyna), pokonanie mechanizmów obronnych gospodarza i wzbudzenie szkodliwej odpowiedzi zapalnej gospodarza.

Charakterystyka niektórych badanych czynników wirulencji E. coli

 

Fimbrie typu 1

 

Są strukturami posiadającymi zdolność aglutynacji czerwonych krwinek oraz przyczepiania się do innych komórek gospodarza, np. błon śluzowych, kolonizują usta, pochwę oraz jelito. Występuje ścisła zależność między specyficznym wiązaniem się komórek bakterii a infekcjami, jakie wywołują. Fimbrie pełnią znaczącą rolę jako mediatory w infekcjach wywołanych przez Escherichia coli, szczególnie w zakażeniach układu moczowego, w chorobach gastroentorologicznych, są także obecne na powierzchni komórek niepatogennych.

1. coli posiada geny kodujące fimbrie typu 1: A, B, C i D. Ekspresja genów jest uzależniona od fazy, w jakiej znajduje się bakteria, wyróżnia się bowiem 2 stany: fimbrialny oraz bezfimbrialny. Za kontrolę pomiędzy fazami dla fimbrii typu 1 odpowiedzialne są fimB oraz fimE. Trzy dodatkowe geny: fimF, fimG i fim H, pełnią funkcję regulatorową oraz odpowiadają za właściwości adhezyjne.

 

Fimbrie typu S (kodowane przez gen sfa)

Jest to grupa fimbrii rozpoznająca kwas sialowy występujący na powierzchni ludzkich erytrocytów. Fimbrie S są morfologicznie bardzo podobne do fimbrii typu 1 i fimbrii typu P u Escherichia coli. Mają od 1 do 2 µm długości, a wielkość podjednostek budujących je jest taka sama jak fimbrii typu 1. Adhezyny fimbrii S były czynnikiem najczęściej znajdywanym wśród izolatów wywołujących zapalenie opon oraz sepsę. Istotna jest również umiejętność wiązania się fimbrii do składników macierzy pozakomórkowej oraz sialoglikoprotein komórek śródbłonka naczyń włosowatych mózgu. Interakcja ta może tłumaczyć migrację bakterii przez bariery fizjologiczne.

 

Fimbrie typu P

Wiążą się do sekwencji α-D-Galp-(1-4)-β-D-Galp węglowodanów wchodzących w skład glikosfingolipidów, powiązanych z antygenem D erytrocytów. Pile typu P są kodowane przez zestaw 11 genów zorganizowanych w klaster genów pap znajdujących się na chromosomie. Adhezyna PapG występuje w 3 molekularnych wariantach: PapGI, PapGII, PapGIII, przy czym allel III PapG jest dominującym wśród szczepów E. coli powodujących zapalenia pęcherza moczowego kobiet i dzieci, a wariant PapGII jest często spotykany wśród szczepów powodujących bakteriemię u ludzi.

 

Fimbrie typu F1C

Pile F1C nie posiadają zdolności hemaglutynacji, jednak charakteryzują się umiejętnością adherencji do komórek nabłonka jamy ustnej, dróg żółciowych oraz nerki. Fimbrie F1C (foc) są powiązane z fimbriami typu S (sfa). Oba rodzaje wykazują wysoki stopień homologii, podobieństwo w sekwencji DNA oraz obecność wspólnych epitopów na odpowiednich białkach fimbrialnych, jednak różnią się specyficznością receptorową; fimbrie typu S rozpoznają kwas neuraminowy, natomiast fimbrie typu F1C laktosylceramidy zawierające glikolipidy.

Adhezyny Afa/Dr

Rodzina adhezyn Afa/Dr obejmuje adhezyny fimbrialne, którymi są fimbrie typu Dr i F1845, oraz adhezyny afimbrialne Afa, występująea głównie wśród uropatogennych szczepów E.coli. Wśród czynników wirulencji, powodujących kolonizację komórek nabłonka układu moczowego, fimbrie Dr zajmują trzecie miejsce pod względem częstości występowania. Ustępują miejsca tylko fimbriom typu P oraz typu 1.

 

Cytotoksyczny czynnik nekrotyzujący (CNF)

Kodowany jest przez gen cnf. Reorganizuje cytoszkielet komórek głównie poprzez nieodwracalne formowanie się cienkich wiązek włókien aktynowych, co uniemożliwia podziały komórkowe. Stosunkowo rzadko występuje wśród szczepów E. coli izolowanych z odbytu ludzi zdrowych.

 

Bakteriocyna Usp

Mechanizm działania bakteriocyn polega głównie na tworzeniu porów w błonie cytoplazmatycznej oraz zakłócenie syntezy ściany komórkowej. Powstałe pory powodują wypływ aminokwasów, jonów, ATP, co prowadzi do zaburzenia syntezy DNA, RNA, białek i polisacharydów. Zahamowany jest też transport składników odżywczych. Gen usp zapisany jest na DNA genomowym dużej liczby szczepów uropatogennych E.coli jako składnik małych wysp patogenności. Bakteriocyna Usp posiada aktywność egzonukleolityczną.

 

Hemolizyna α

Jest białkiem, które przeprowadza lizę komórek poprzez utworzenie porów w błonie komórkowej  erytrocytów i leukocytów  oraz komórkach kanalików nerkowych. W organizmie gospodarza bakterie często napotykają niesprzyjające warunki, m.in. niedobór składników pokarmowych oraz niezbędnych jonów. Jeśli stężenie jonów jest niskie i limituje wzrost bakterii, następuje ekspresja genów kodujących hemolizynę. Liza komórek, w których zawarty jest hem, dostarcza jonów komórce bakteryjnej. Cztery geny (hlyA, hlyB, hlyC i hlyD) są zaangażowane w produkcję hemolizyny α. Genem strukturalnym jest hlyA. Występowanie hemolizyny jest charakterystyczne głównie dla szczepów EHEC i UPEC.

Siderofory

Żelazo jest niezbędne dla wzrostu bakterii, gdyż wchodzi w skład wielu bakteryjnych układów enzymatycznych i jest kofaktorem w różnych reakcjach biochemicznych. Dlatego bakterie wykształciły na drodze ewolucji zdolność pozyskiwania żelaza w warunkach jego niedoboru. Do tego celu służą substancje organiczne zwane sideroforami, będące produktami metabolizmu bakterii. Są one wydzielane pozakomórkowo. Tworzą rozpuszczalne w wodzie kompleksy z żelazem (III), powodując tym samym zwiększenie stężenia jego form przyswajalnych.

Yersinia-baktyna

Jest to system sideroforów kodowany przez wyspy wysokiej patogenności i nadający wysoką wirulencję szczepom rodzaju Yersinia. Wyspy te są również szeroko rozpowszechnione wśród szczepów rodziny Enterobacteriaceae, w tym u E. coli. Typowy system pozyskiwania żelaza składa się z niskocząsteczkowego związku chelatującego żelazo trójwartościowe znanego jako siderofor, połączonego z receptorem zakotwiczonym w błonie. Amplifikacji poddawano gen fyuA, który koduje receptor dla yersinia-baktyny.

 

Aerobaktyna

Jest ona sideroforem bakteryjnym, charakterystycznym dla szczepów Escherichia coli wywołujących odmiedniczkowe zapalenie nerek oraz zapalenie pęcherza moczowego. Umożliwia wzrost bakterii w warunkach niedoboru jonów żelaza. Gen iutA koduje  receptor dla aerobaktyny.

 

Enterobaktyna Iha o podwójnej funkcji receptora i adhezyny

Białko Iha pełni w komórce bakteryjnej funkcję receptora dla siderofora. Ponadto stwierdzono, że umożliwia adherencję komórek bakteryjnych do komórek nabłonka gospodarza. Geny iha kodujące tę enterobaktynę znajdują się na plazmidzie pIJ111. Ich ekspresja uzależniona jest od ilości żelaza i systemu regulacji jego pobierania, a nie od kontaktu z komórkami gospodarza. Podczas kontaktu patogennych szczepów Escherichia coli z komórkami gospodarza następuje indukcja ekspresji białka regulującego stężenie żelaza w komórce.

Otoczka K1

Otoczki bakteryjne są ważnym czynnikiem wirulencji, nadają bowiem właściwości umożliwiające wywołanie zakażenia, chroniąc bakterie przed reakcją obronną organizmu. Posiadają charakter hydrofilowy, co chroni je przed tzw. powierzchniową fagocytozą. Za powstanie otoczki odpowiedzialna jest grupa 14 genów operonu kps, obejmująca fragment DNA o wielkości 17 kb. Operon ten dzieli się na 3 regiony. Amplifikacji został poddany gen kpsMTII, który koduje białka potrzebne do transportu polimeru z miejsca jego syntezy na powierzchnię komórki przez błonę wewnętrzną.

 

Inwazyna IbeA

Jest białkiem o trzech transbłonowych domenach, głównym wyznacznikiem decydującym o inwazji szczepów E.coli do komórek śródbłonka naczyń włosowatych mózgu oraz zasadniczym czynnikiem wywołującym zapalenie opon mózgowych. Gen ibeA nie wykazuje homologii do żadnego innego genu, co sugeruje, że jest to unikalne białko wśród białek odpowiedzialnych za wirulencję.

Określenie zdolności badanych szczepów E. coli do tworzenia biofilmu metodami molekularnymi

Potencjalna zdolność badanych szczepów Escherichia coli do wytwarzania biofilmu zostanie przebadana poprzez amplifikację techniką PCR fragmentu genu agn43 zwanego też genem flu. Białko antygenowe Agn43 odpowiedzialne jest za agregację komórek E. coli, która jest pierwszym etapem w tworzeniu biofilmu.

Piśmiennictwo:

1. Krawczyk B, Samet A, Leibner J, Śledzińska A, Kur J. Evaluation of a PCR melting profile (PCR MP) technique for bacterial strain differentiation. J Clin Microbiol 2006; 44: 2327-32.

1. Krawczyk B, Stojowska K, Leibner-Ciszak J. Opracowanie zestawu diagnostycznego do genetycznego typowania szczepów bakteryjnych metodą PCR MP. Med Dośw Mikrobiol 2008; 60(2):139-54.
2. Clermont O, Bonacorsi P, Bingen E. Rapid and Simple Determination of the Escherichia coli Phylogenetic Group. Appl Environ Microbiol 2000; 66(10): 4555-8.